Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL5A1: sc-401579-ACT

COL5A1 code la chaîne pro‑α1(V) du collagène de type V, un collagène fibrillaire qui s’assemble avec le collagène de type I pour réguler la fibrillogenèse du collagène et l’architecture de la matrice extracellulaire (MEC). En contrôlant la nucléation et le diamètre des fibres de collagène, COL5A1 influence la résistance à la traction des tissus conjonctifs, l’adhérence cellule–matrice et les programmes de mécanotransduction qui façonnent le développement et le remodelage tissulaires. L’organisation de la MEC associée à COL5A1 recoupe des voies impliquées dans la réparation des plaies et le remodelage stromal, notamment la signalisation intégrine/FAK et le dépôt de matrice lié au TGF‑β. Les perturbations génétiques de COL5A1 sont impliquées dans des maladies héréditaires du tissu conjonctif, et les modifications de son expression sont fréquemment étudiées dans la fibrose et la biologie du microenvironnement tumoral.

COL5A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL5A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL5A1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL5A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL5A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL5A1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL5A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL5A1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL5A1 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL5A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.