CKIP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403898-ACT

PLEKHO1 codifica a proteína 1 interagente com a caseína quinase 2 (CKIP-1), um adaptador contendo um domínio de homologia à pleckstrina que se localiza na membrana plasmática e coordena interações proteína–proteína que controlam a transdução de sinais e o turnover proteico. A CKIP-1 tem sido associada à regulação da sinalização Akt/PI3K e de processos dependentes de ubiquitina por meio de interações com ligases E3 e fosfatases, influenciando assim o crescimento celular, a diferenciação e a organização do citoesqueleto. Na biologia óssea, a CKIP-1 está implicada na função de osteoblastos e em vias de formação óssea, enquanto estudos mais amplos associam alterações na expressão de PLEKHO1 a mudanças em programas de proliferação e resposta ao estresse relevantes para contextos de câncer e inflamação. Essas características tornam PLEKHO1 um alvo útil para dissecar redes de sinalização próximas à membrana e programas transcricionais subjacentes à homeostase tecidual.

CKIP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLEKHO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CKIP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLEKHO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLEKHO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CKIP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLEKHO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CKIP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CKIP-1 em células tumorais com expressão de PLEKHO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.