CHMP4B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401802-ACT

O CHMP4B humano codifica um componente central do complexo ESCRT-III, que polimeriza em membranas endossomais para promover a constrição e a cisão de membranas durante a biogênese de corpos multivesiculares. Por meio do tráfego dependente de ESCRT, o CHMP4B ajuda a regular a redução (downregulation) de receptores, o direcionamento lisossomal e a degradação de complexos de sinalização, influenciando vias ligadas à sinalização por fatores de crescimento e à homeostase celular. A atividade do ESCRT-III também sustenta etapas tardias da abscisão na citocinese e contribui para a reformação do envelope nuclear e o reparo da membrana plasmática. A desregulação de componentes do ESCRT, incluindo o CHMP4B, tem sido associada a alterações na dinâmica endo-lisossomal e é relevante para pesquisas sobre neurodegeneração, sinalização em células cancerosas e mecanismos de brotamento de vírus.

CHMP4B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CHMP4B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CHMP4B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CHMP4B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CHMP4B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CHMP4B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CHMP4B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CHMP4B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CHMP4B em células tumorais com expressão de CHMP4B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.