ChM-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403523-ACT

CNMD codifica la condromodulina-1 (ChM-1), una proteina secreta associata alla matrice extracellulare, arricchita nella cartilagine avascolare e coinvolta nel mantenimento del microambiente anti-angiogenico dei tessuti connettivi in sviluppo e maturi. ChM-1 partecipa alla regolazione del comportamento delle cellule endoteliali, dell’omeostasi della cartilagine e del rimodellamento della matrice extracellulare, collegandosi a vie che coordinano la vascolarizzazione dei tessuti e la differenziazione condrogenica. Un’alterata espressione di CNMD è stata studiata in contesti di degenerazione cartilaginea e neovascolarizzazione aberrante, in cui cambiamenti nella segnalazione della matrice possono influenzare le risposte infiammatorie e ipossiche. Di conseguenza, CNMD è ampiamente studiato nella biologia muscoloscheletrica, nella biologia vascolare e nella ricerca sul microambiente tumorale come modulatore del dialogo tra stroma e compartimento vascolare.

ChM-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CNMD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ChM-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CNMD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CNMD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ChM-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CNMD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ChM-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ChM-1 nelle cellule tumorali con espressione di CNMD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.