Cdk7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400665-ACT

Humanes CDK7 kodiert die Cyclin-abhängige Kinase 7 (Cdk7), ein Enzym mit Doppelfunktion, das innerhalb des CDK7–Cyclin-H–MAT1-Komplexes als CDK-aktivierende Kinase wirkt und zugleich ein zentraler Bestandteil des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIIH ist. Durch die Phosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II und die Aktivierung von Zellzyklus-CDKs koordiniert Cdk7 den Beginn der Transkription, die Freisetzung der promotorproximalen Pause (Pause-Release) sowie einen geordneten Ablauf des Zellzyklus. Die CDK7-Aktivität ist eng in die Signalwege der DNA-Schadensantwort und die transkriptionsgekoppelte Nukleotid-Exzisionsreparatur eingebunden und verknüpft so die Genomstabilität mit Entscheidungen über das Zellschicksal. Eine Fehlregulation CDK7-abhängiger Transkriptionsprogramme und der Zellzykluskontrolle wird häufig im Zusammenhang mit proliferativen Zuständen und onkogenen Transkriptionsnetzwerken untersucht, wodurch CDK7 einen besonders wertvollen Angriffspunkt für mechanistische Analysen von Signalwegen darstellt.

Cdk7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdk7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdk7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdk7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdk7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.