CCNB1/cyclin B1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400114-ACT

CCNB1 codifica la ciclina B1, una subunità regolatoria fondamentale del complesso CDK1 che guida la transizione G2/M e coordina l’ingresso in mitosi. L’accumulo della ciclina B1 e la sua traslocazione nel nucleo favoriscono la condensazione dei cromosomi, la disgregazione dell’involucro nucleare e l’assemblaggio del fuso mitotico, mentre la sua tempestiva degradazione mediata dall’ubiquitina a opera dell’APC/C supporta l’uscita dalla mitosi. L’attività di CCNB1 si integra con i checkpoint del danno al DNA e con le vie di sorveglianza del ciclo cellulare per garantire una corretta replicazione e segregazione del genoma. Un’espressione deregolata di CCNB1 è frequentemente associata a proliferazione aberrante, instabilità cromosomica e fenotipi del ciclo cellulare legati ai tumori, rendendolo un marcatore ampiamente utilizzato e un nodo meccanicistico centrale negli studi sul controllo della mitosi.

CCNB1/cyclin B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCNB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCNB1/cyclin B1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCNB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCNB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCNB1/cyclin B1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCNB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCNB1/cyclin B1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCNB1/cyclin B1 nelle cellule tumorali con espressione di CCNB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.