CCDC111 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-404310-ACT

PRIMPOL（別名CCDC111）は、複製フォークが損傷部位や二次構造DNAに遭遇した際に、複製の再開とDNA損傷耐性を可能にするプライマーゼ／ポリメラーゼであるPrimPolをコードする。PrimPolは、停止したフォークの下流での再プライミングを支援し、複製後に生じたギャップの充填にも寄与することから、その活性は、ATR依存性の複製ストレス応答と交差するゲノム維持経路と結び付けられている。PRIMPOL機能の変化は、変異原性の増加や遺伝毒性ストレスへの感受性上昇と関連しており、複製忠実性や内因性／外因性DNA損傷に対する細胞応答の研究において重要である。複製に課題を抱えた複製フォークで働く核内酵素として、PRIMPOLは複製ストレス、フォーク安定性、染色体完全性の維持という文脈で頻繁に検討される。

CCDC111 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性PRIMPOLの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CCDC111 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における PRIMPOL 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はPRIMPOL転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CCDC111の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のPRIMPOL遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCCDC111依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびPRIMPOL発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCCDC111経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。