cathepsin L Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419880-ACT

O gene Ctsl de camundongo codifica a catepsina L, uma protease cisteínica lisossomal que promove a renovação de proteínas intracelulares ao clivar cargas endocitadas e autofágicas após sua entrega a compartimentos endolisossomais ácidos. A catepsina L contribui para o processamento de antígenos para apresentação por MHC de classe II, para a remodelação da matriz extracelular após sua secreção e para a regulação proteolítica de proteínas de sinalização, vinculando-a à modulação imune e à homeostase tecidual. A atividade de Ctsl se intersecciona com as vias de lisossomo–autofagia, a maturação do fagossomo e redes de proteases que moldam a proteostase e decisões de destino celular. A desregulação da catepsina L tem sido associada a processos inflamatórios, remodelação relacionada à fibrose e fenótipos de invasão de células tumorais, tornando Ctsl um alvo relevante para estudos mecanísticos de biologia dependente de proteases.

cathepsin L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ctsl sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cathepsin L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ctsl em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ctsl, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cathepsin L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ctsl nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cathepsin L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cathepsin L em células tumorais com expressão de Ctsl silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.