Calregulin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400775-ACT

O CALR humano codifica a calreticulina, uma chaperona multifuncional do retículo endoplasmático (RE) e uma proteína de alta capacidade de ligação a Ca2+ que sustenta o controlo de qualidade do dobramento de glicoproteínas através do ciclo calnexina/calreticulina e de processos associados ao RE. A calreticulina influencia a homeostase do cálcio intracelular, a sinalização de stress do RE e a apresentação de antigénios ao contribuir para o carregamento de péptidos no MHC de classe I, ligando a proteostase a vias relacionadas com a imunidade. Para além do RE, o CALR tem sido associado à regulação da adesão e da sinalização celulares por meio de interações com integrinas e outros complexos associados à membrana. A expressão e a função desreguladas de CALR são relevantes em modelos de stress do RE, morte celular imunogénica e mecanismos associados a neoplasias mieloides, sustentando a sua utilização em estudos de proteostase e sinalização inflamatória.

Calregulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CALR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Calregulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CALR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CALR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Calregulin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CALR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Calregulin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Calregulin em células tumorais com expressão de CALR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.