CAD CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403028-ACT

DNAフラグメンテーション因子サブユニットβ（DFFB、別名カスパーゼ活性化DNase：CAD）は、アポトーシスの過程で阻害因子ICADから解離した後に活性化され、ヌクレオソーム間DNA切断を担うエンドヌクレアーゼです。活性化CADはクロマチン断片化、アポトーシス小体の形成、DNA損傷シグナル伝達に寄与し、プログラム細胞死とゲノム恒常性維持経路を結び付けます。そのためDFFB活性は、アポトーシス制御、免疫恒常性、遺伝毒性ストレスに対する細胞応答の研究において重要です。アポトーシス時のDNA断片化の制御異常は、がんにおける生存優位性、炎症性表現型、神経変性過程と関連していることが報告されており、DFFBは機序解明のための有用な研究ノードとなります。

CAD CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性DFFBの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CAD CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における DFFB 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はDFFB転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CADの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のDFFB遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCAD依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびDFFB発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCAD経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。