CA IX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400905-ACT

O gene humano CA9 codifica a anidrase carbônica IX (CA IX), uma enzima associada à membrana e induzível por hipóxia, que catalisa a hidratação reversível de CO₂ para regular a acidificação extracelular e a homeostase do pH intracelular. A CA IX sustenta a adaptação celular ao estresse de baixo oxigênio e se integra à sinalização de HIF-1, às redes de transporte iônico e à reprogramação metabólica que influenciam a sobrevivência celular, a migração e o tamponamento do microambiente. A expressão desregulada de CA9 é frequentemente estudada como marcador de nichos hipóxicos e acidificados e está ligada a alterações no balanço redox e a fenótipos associados à invasão em modelos de doenças de tecido sólido. Essas propriedades tornam a CA IX um alvo útil para investigar sinalização dependente de pH, programas transcricionais responsivos à hipóxia e pressões seletivas impulsionadas pelo microambiente.

CA IX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CA9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CA IX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CA9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CA9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CA IX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CA9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CA IX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CA IX em células tumorais com expressão de CA9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.