CA II CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401059-ACT

ヒトのCA2は、炭酸脱水酵素II（CA II）をコードしている。CA IIは高い活性をもつ細胞質型の金属酵素で、CO₂の可逆的な水和反応を触媒して重炭酸イオン（HCO₃⁻）とプロトン（H⁺）を生成し、細胞内pHの制御およびCO₂／重炭酸輸送を支える。CA IIは重炭酸トランスポーターやイオン交換体と連動することで、酸塩基恒常性、上皮でのイオン輸送、ならびに複数組織における代謝性のpH緩衝に寄与する。炭酸脱水酵素活性の破綻は、細胞内の酸性化や代謝適応の変化と関連することが示されており、腎尿細管機能や腫瘍微小環境のpHといった文脈でしばしば研究されている。そのためCA2は、CO₂／HCO₃⁻依存性シグナル伝達、イオン恒常性、pH感受性酵素ネットワークの解明に有用な標的である。

CA II CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性CA2の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CA II CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における CA2 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はCA2転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CA IIの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のCA2遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCA II依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびCA2発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCA II経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。