C5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401533-ACT

Il componente 5 del complemento umano (C5) codifica un effettore centrale della cascata del complemento, che viene scisso in C5a e C5b durante l’attivazione delle vie classica, lectinica o alternativa. C5a agisce come una potente anafilotossina che segnala attraverso i recettori di C5a promuovendo chemotassi, rilascio di citochine e attivazione delle cellule mieloidi, mentre C5b avvia l’assemblaggio del complesso terminale di attacco alla membrana (C5b–C9) inducendo la lisi delle cellule bersaglio. Attraverso questi processi, C5 integra il riconoscimento immunitario innato con l’amplificazione dell’infiammazione e la difesa antimicrobica. L’attivazione disregolata di C5 è spesso studiata nel contesto dell’infiammazione mediata dal complemento, del danno vascolare e del danno tissutale associato a malattie autoimmuni, in cui un’alterata segnalazione di C5a e la formazione del MAC possono contribuire alla patologia.

C5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C5 nelle cellule tumorali con espressione di C5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.