BNPI Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403333-ACT

SLC17A7 codifica o transportador vesicular de glutamato BNPI (VGLUT1), uma proteína de membrana das vesículas sinápticas que carrega glutamato para dentro das vesículas, sustentando a liberação quantal de neurotransmissores em sinapses excitatórias. Ao controlar o empacotamento presináptico de glutamato, o BNPI influencia a transmissão sináptica, a plasticidade dependente de atividade e o equilíbrio excitação–inibição nos circuitos neurais. A função de SLC17A7 está intimamente ligada a vias de sinalização neuronal que moldam aprendizagem e memória, incluindo processos que regulam a ciclagem de vesículas, a homeostase de neurotransmissores e a excitabilidade dos circuitos. Alterações na sinalização glutamatérgica envolvendo SLC17A7 têm sido investigadas no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, bem como de suscetibilidade a crises convulsivas e de mecanismos de estresse excitotóxico.

BNPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC17A7 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BNPI O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC17A7 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC17A7, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BNPI. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC17A7 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BNPI no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BNPI em células tumorais com expressão de SLC17A7 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.