Bcl-x_S/L Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400170-ACT

BCL2L1 codifica le isoforme proteiche Bcl-xS/L, regolatori centrali dell’apoptosi mitocondriale che modulano la permeabilizzazione della membrana esterna attraverso interazioni con membri della famiglia BCL2 come BAX e BAK. Lo splicing alternativo genera la forma anti-apoptotica Bcl-xL e la forma pro-apoptotica Bcl-xS, collegando BCL2L1 alle decisioni sul destino cellulare durante lo sviluppo, l’omeostasi immunitaria e le risposte allo stress cellulare. L’attività di BCL2L1 integra segnali provenienti dalle vie dei fattori di crescita e dello stress, influenzando l’attivazione delle caspasi, l’integrità mitocondriale e la sopravvivenza in condizioni di sfida genotossica o metabolica. L’espressione deregolata di BCL2L1 e l’equilibrio tra isoforme sono spesso oggetto di studio nella sopravvivenza delle cellule tumorali, nei meccanismi di resistenza alle terapie e in modelli rilevanti per la neurodegenerazione legati alla vulnerabilità apoptotica.

Bcl-xS/L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BCL2L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Bcl-xS/L Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BCL2L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BCL2L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Bcl-xS/L. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BCL2L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Bcl-xS/L nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Bcl-xS/L nelle cellule tumorali con espressione di BCL2L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.