Bak Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400646-ACT

O BAK1 humano codifica Bak, um efetor pró-apoptótico da família BCL-2 que oligomeriza na membrana externa mitocondrial para promover a liberação de citocromo c e a ativação de caspases durante a apoptose intrínseca. Bak integra sinais de estresse como dano ao DNA, estresse do RE e privação de fatores de crescimento por meio de proteínas apenas-BH3, atuando em conjunto com BAX para executar a permeabilização da membrana externa mitocondrial. Alterações na atividade de BAK1 podem deslocar o equilíbrio entre sobrevivência e morte celular programada, influenciando a biologia tumoral, a homeostase imune e as respostas a lesão tecidual. Como um regulador central da apoptose, Bak é amplamente estudado em vias que governam a integridade mitocondrial, a sinalização de estresse celular e a sensibilidade a estímulos pró-morte.

Bak O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BAK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Bak O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BAK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BAK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Bak. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BAK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Bak no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Bak em células tumorais com expressão de BAK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.