ATR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400335-ACT

ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) é uma proteína quinase de serina/treonina que atua como um sensor e efetor central da resposta ao estresse de replicação. Ativada principalmente por DNA de fita simples revestido por RPA, a ATR coordena o checkpoint da fase S por meio da fosforilação de substratos como CHK1, para estabilizar forquilhas de replicação estagnadas, regular o disparo de origens e promover o reparo do DNA. A sinalização de ATR integra-se à recombinação homóloga, ao reparo por excisão de nucleotídeos e a redes mais amplas de manutenção do genoma para limitar a instabilidade cromossômica. A atividade desregulada da via de ATR está associada ao aumento da carga mutacional e a respostas alteradas ao estresse genotóxico endógeno ou exógeno, tornando-a relevante para estudos de biologia do câncer e sinalização de dano ao DNA.

ATR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATR em células tumorais com expressão de ATR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.