ATP6AP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404162-ACT

ATP6AP1 codifica uma subunidade acessória do complexo H+-ATPase vacuolar (V-ATPase), que sustenta a acidificação de vesículas e organelos necessária para o tráfego endossomal, a função lisossomal e o processamento de proteínas na via secretora. Ao influenciar eventos de triagem e maturação dependentes de pH, a ATP6AP1 contribui para a reciclagem de recetores, o fluxo autofagia–lisossoma e uma regulação mais ampla da proteostase. Alterações na atividade de fatores acessórios da V-ATPase têm sido associadas a perturbações na glicosilação, na função de células imunitárias e na homeostase metabólica, tornando a ATP6AP1 um ponto útil para estudar respostas ao stress de organelos. Assim, a ATP6AP1 humana é relevante para investigar mecanismos que ligam a acidificação vesicular a redes de sinalização e à adaptação celular sob stress.

ATP6AP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6AP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ATP6AP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6AP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6AP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ATP6AP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6AP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ATP6AP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ATP6AP1 em células tumorais com expressão de ATP6AP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.