ASPP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404330-ACT

PPP1R13B codifica a ASPP1, um regulador rico em prolina que se liga a membros da família p53 e modula programas transcricionais que controlam a apoptose, a paragem do ciclo celular e as respostas celulares ao stress. A ASPP1 atua na interface entre a sinalização de dano no ADN e o controlo transcricional associado à cromatina, influenciando o equilíbrio entre a sobrevivência e a morte celular programada. Alterações na expressão de PPP1R13B ou na regulação mediada por ASPP1 têm sido associadas a uma atividade desregulada da via do p53 observada em diversos contextos relevantes para o cancro e noutros distúrbios que envolvem controlo apoptótico comprometido. Como resultado, PPP1R13B/ASPP1 é frequentemente estudado em vias que ligam o stress genotóxico, redes de supressores tumorais e remodelação transcricional.

ASPP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R13B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASPP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R13B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R13B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASPP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R13B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASPP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASPP1 em células tumorais com expressão de PPP1R13B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.