ASF1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404071-ACT

ASF1A codifica a proteína anti-silencing function 1A, uma chaperona conservada de histonas H3–H4 que coordena a montagem e a desmontagem de nucleossomos durante a replicação do DNA, a transcrição e o reparo de danos ao DNA. Ao interagir com reguladores da cromatina como CAF-1 e HIRA, a ASF1A sustenta a remontagem da cromatina acoplada à replicação, a dinâmica do suprimento de histonas e a manutenção de estados epigenéticos ao longo do ciclo celular. Alterações na atividade de ASF1A podem perturbar programas de estabilidade do genoma e a acessibilidade da cromatina, associando esse fator à proliferação desregulada e a respostas ao estresse observadas no câncer e em outras doenças com defeitos de remodelamento de cromatina. Como um nó central na homeostase da cromatina, a ASF1A é frequentemente estudada em vias que governam o estresse replicativo, a sinalização de checkpoints e a reprogramação transcricional.

ASF1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ASF1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASF1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ASF1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ASF1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASF1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ASF1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASF1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASF1A em células tumorais com expressão de ASF1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.