Arrestin-C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403284-ACT

ARR3 codifica l’arrestina-C, un’arrestina arricchita nei fotorecettori a cono che si lega alle opsine fosforilate e attivate dalla luce per terminare la segnalazione mediata da proteine G e facilitare la desensibilizzazione del recettore nella cascata della fototrasduzione. Regolando la disattivazione dei GPCR e il trafficking recettoriale, l’arrestina-C contribuisce a determinare l’ampiezza del segnale e le cinetiche di recupero nei coni retinici e supporta l’adattamento visivo. La disregolazione della segnalazione dei GPCR nei coni e dello spegnimento mediato da arrestina è stata associata a disfunzioni retiniche, rendendo ARR3 un utile punto di accesso molecolare per studiare le interazioni tra GPCR e arrestine e il controllo della segnalazione specifico dei coni. ARR3 rappresenta inoltre un modello maneggevole per analizzare processi dipendenti dalle arrestine nella biologia delle ciglia/dei segmenti esterni e nella segnalazione dei neuroni sensoriali.

Arrestin-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARR3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arrestin-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARR3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARR3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arrestin-C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARR3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arrestin-C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arrestin-C nelle cellule tumorali con espressione di ARR3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.