APOBEC3A Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-418267-LAC

L’APOBEC3A umano (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3A) è una deaminasi della citidina che catalizza l’editing C→U nel DNA e nell’RNA a singolo filamento, contribuendo all’immunità intrinseca limitando la replicazione virale e l’attività dei retroelementi. Agendo sul ssDNA esposto durante lo stress replicativo e la riparazione del DNA, APOBEC3A si interseca con le vie di mantenimento del genoma e, se deregolata, può aumentare il carico mutazionale. Un’attività aberrante di APOBEC3A è stata collegata a firme mutazionali caratteristiche osservate in molteplici tipi di tumore ed è studiata nel contesto dell’instabilità genomica associata all’infiammazione. I ricercatori utilizzano APOBEC3A come modello per analizzare la restrizione antivirale, le risposte al danno del DNA e i meccanismi che plasmano la mutagenesi somatica.

Le particelle di attivazione lentivirale APOBEC3A (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di APOBEC3A in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale APOBEC3A (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione APOBEC3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di APOBEC3A. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo APOBEC3A e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.