Ape2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407307-ACT

O APEX2 humano codifica a endonuclease apurínica/apirimidínica 2 (Ape2), uma nuclease multifuncional que participa da manutenção da integridade do genoma durante o reparo por excisão de bases e o processamento de lesões abásicas no DNA. A Ape2 contribui para as respostas a danos no DNA associadas à replicação e sustenta a sinalização de checkpoint por meio da coordenação com fatores de reparo e de replicação, ajudando a preservar a estabilidade da forquilha sob estresse genotóxico. Alterações na atividade de APEX2 têm sido associadas a aumento da carga mutacional e maior sensibilidade ao dano oxidativo, vinculando essa via a mecanismos relevantes para a biologia do câncer e outros distúrbios decorrentes de reparo de DNA comprometido. Como resultado, APEX2 é frequentemente estudado no contexto de manutenção do genoma, estresse de replicação e respostas celulares a agentes que causam dano ao DNA.

Ape2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de APEX2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ape2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus APEX2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição APEX2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ape2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus APEX2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ape2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ape2 em células tumorais com expressão de APEX2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.