AP-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404336-ACT

O TFAP4 codifica a proteína 4 ligante de intensificadores ativadores (AP-4), um fator de transcrição do tipo hélice–alça–hélice básica com zíper de leucina, que se liga a motivos E-box e regula programas que controlam a proliferação, a diferenciação e a progressão do ciclo celular. A AP-4 integra sinais de vias oncogênicas e do desenvolvimento, incluindo redes transcricionais conduzidas por MYC, e influencia a transição epitélio–mesênquima, a migração e a adaptação metabólica por meio de genes-alvo a jusante. A expressão desregulada de TFAP4 tem sido associada a alterações no controle do crescimento e a fenótipos invasivos em múltiplos contextos relevantes para o câncer, o que a torna útil para estudar a reprogramação transcricional e a regulação gênica dependente do contexto. Como regulador nuclear de ligação ao DNA, a AP-4 oferece um ponto acessível para dissecar a atividade de promotores/intensificadores e o controle da expressão gênica dependente da cromatina.

AP-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TFAP4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AP-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TFAP4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TFAP4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AP-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TFAP4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AP-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AP-4 em células tumorais com expressão de TFAP4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.