AMPKγ2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-404970-LAC

PRKAG2 codifica la subunità regolatoria γ2 della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK), un sensore energetico eterotrimerico centrale che collega i rapporti cellulari AMP/ADP:ATP alla riprogrammazione metabolica. AMPKγ2 regola il legame dei nucleotidi e il controllo allosterico del complesso catalitico, influenzando le vie a valle che coordinano l’assorbimento del glucosio, l’ossidazione degli acidi grassi, l’omeostasi mitocondriale e la soppressione dei programmi anabolici attraverso nodi come mTORC1 e l’autofagia. Nei tessuti umani, PRKAG2 è altamente rilevante per la fisiologia ad alta richiesta energetica ed è stato associato all’accumulo cardiaco di glicogeno e ad anomalie della conduzione, a sostegno del suo impiego in studi meccanicistici dell’accoppiamento tra metabolismo ed elettrofisiologia. L’alterazione dell’attività di AMPKγ2 fornisce inoltre indicazioni utili per modelli di adattamento allo stress, segnalazione dei nutrienti e controllo di qualità degli organelli in diversi tipi cellulari.

Le particelle di attivazione lentivirale AMPKγ2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di PRKAG2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale AMPKγ2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione PRKAG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di AMPKγ2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo PRKAG2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.