Plásmido CRISPR de Activación (h) AMPKγ1: sc-418058-ACT

PRKAG1 codifica la subunidad reguladora γ1 de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), un sensor central de la energía celular que vincula los cambios en las proporciones de AMP/ADP respecto a ATP con la reprogramación metabólica. AMPKγ1 contribuye a la unión de nucleótidos y a la regulación alostérica del complejo AMPK, e influye en el control mediado por fosforilación de la captación de glucosa, la oxidación de ácidos grasos, la biogénesis mitocondrial y la autofagia. Mediante su integración con mTORC1, la señalización de la insulina y las vías de respuesta al estrés, la actividad de AMPK ayuda a coordinar el crecimiento celular con la disponibilidad de nutrientes. La señalización desregulada de AMPK y la expresión alterada de PRKAG1 se han relacionado con disfunción metabólica y podrían modular la adaptación de las células tumorales al estrés energético, lo que convierte a PRKAG1 en una diana útil para estudios mecanísticos de la bioenergética.

AMPKγ1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRKAG1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AMPKγ1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRKAG1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRKAG1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AMPKγ1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRKAG1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AMPKγ1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AMPKγ1 en células tumorales con expresión de PRKAG1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.