AMPK alpha 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400104-ACT

PRKAA1 kodiert AMPK‑α1, die katalytische Untereinheit des AMP‑aktivierten Proteinkinase‑Komplexes, der den zellulären Energiestatus erfasst und adaptive Stoffwechselantworten koordiniert. Nach Aktivierung moduliert AMPK die Glukoseaufnahme, die Fettsäureoxidation, die mitochondriale Biogenese und die Autophagie und dämpft zugleich anabole Signalwege, unter anderem durch Crosstalk mit mTORC1 und die Regulation transkriptioneller Programme. AMPK‑α1 integriert Signale von upstream‑Kinasen wie LKB1 und CaMKK2, um Zellwachstum, Redox‑Gleichgewicht und das Überleben unter Stress zu steuern. Eine fehlregulierte AMPK‑Signalgebung wurde mit Stoffwechselerkrankungen, der metabolischen Reprogrammierung von Krebszellen und inflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was PRKAA1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse auf Signalweg‑Ebene macht.

AMPK alpha 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKAA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPK alpha 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKAA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKAA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPK alpha 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKAA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPK alpha 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPK alpha 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKAA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.