Aminoacylase-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408464-ACT

ACY1 codifica l’aminoacilasi-1, un’idrolasi citosolica zinco-dipendente che catalizza la deacilazione degli N-acil-L-amminoacidi, generando amminoacidi liberi e acetato. Questa attività supporta il recupero degli amminoacidi e il metabolismo dell’azoto e può influenzare i pool intracellulari di substrati che si intersecano con vie metaboliche più ampie e con i percorsi di proteostasi. L’aminoacilasi-1 è inoltre implicata nella gestione di derivati amminoacidici acetilati che derivano dal turnover peptidico, collegando la sua funzione all’omeostasi cellulare in condizioni di stress metabolico. Alterazioni dell’espressione di ACY1 sono state riportate in molteplici contesti patologici, inclusi la riprogrammazione metabolica associata al cancro e gli errori congeniti del metabolismo che coinvolgono il metabolismo degli amminoacidi, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici.

Aminoacylase-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACY1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aminoacylase-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACY1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACY1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aminoacylase-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACY1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aminoacylase-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aminoacylase-1 nelle cellule tumorali con espressione di ACY1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.