Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401340-ACT

L’ALDH1A2 umano codifica l’aldeide deidrogenasi 1-A2, una retinaldeide deidrogenasi citosolica che catalizza l’ossidazione della retinaldeide in acido retinoico, un morfogeno chiave che controlla programmi trascrizionali tramite i recettori dell’acido retinoico. Attraverso la regolazione del metabolismo dei retinoidi e dell’espressione genica dipendente dall’acido retinoico, ALDH1A2 influenza il patterning embrionale, la differenziazione epiteliale e l’omeostasi tissutale, e si interseca con reti di segnalazione dello sviluppo quali la regolazione dei geni HOX. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di ALDH1A2 possono perturbare i gradienti di acido retinoico e sono state associate a malformazioni congenite e a cambiamenti dipendenti dal contesto dello stato di differenziazione, rilevanti per la biologia del cancro e delle malattie fibrotiche. Poiché la segnalazione dell’acido retinoico integra lo stato metabolico con il controllo trascrizionale, ALDH1A2 rappresenta un nodo utile per analizzare il crosstalk tra vie di segnalazione e le decisioni di destino cellulare.

Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALDH1A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALDH1A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALDH1A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALDH1A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aldehyde dehydrogenase 1-A2/ALDH1A2 nelle cellule tumorali con espressione di ALDH1A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.