ALAS-E Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403752-ACT

O ALAS2 humano codifica a 5-aminolevulinato sintase 2 (ALAS-E), a enzima mitocondrial específica da linhagem eritroide e limitante da velocidade na biossíntese do heme, que condensa glicina e succinil-CoA para gerar ácido 5-aminolevulínico. Sua atividade conecta o metabolismo mitocondrial e a utilização de ferro à maturação eritroide ao controlar a disponibilidade de heme para a montagem da hemoglobina. A função de ALAS2 interage com o metabolismo de porfirinas, a homeostase de proteínas mitocondriais e programas de diferenciação de eritrócitos. A desregulação da expressão ou atividade de ALAS2 está implicada em distúrbios hereditários do heme eritroide, incluindo anemia sideroblástica ligada ao X e fenótipos relacionados à protoporfiria, tornando-o um ponto central para estudos mecanísticos da eritropoiese e do equilíbrio ferro–heme.

ALAS-E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALAS2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALAS-E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALAS2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALAS2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALAS-E. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALAS2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALAS-E no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALAS-E em células tumorais com expressão de ALAS2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.