AFX1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402408-ACT

O FOXO4 humano codifica o fator de transcrição forkhead box O AFX1, um regulador responsivo ao estresse que integra a sinalização insulina/IGF-1–PI3K–AKT com programas que controlam a parada do ciclo celular, a resistência ao estresse oxidativo, o metabolismo e a apoptose. A atividade do AFX1 é modulada pelo transporte núcleo–citoplasma dependente de fosforilação e por interações com as vias MAPK e JNK, moldando os outputs transcricionais ligados à homeostase celular. Por meio da regulação de genes-alvo envolvidos em respostas a danos no DNA e no equilíbrio redox, o FOXO4 contribui para fenótipos associados à senescência e para processos de envelhecimento tecidual. A desregulação da sinalização FOXO4/AFX1 tem sido associada à remodelação de vias oncogênicas e à alteração da tolerância ao estresse em múltiplos contextos de doença, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos de controle transcricional.

AFX1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FOXO4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AFX1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FOXO4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FOXO4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AFX1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FOXO4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AFX1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AFX1 em células tumorais com expressão de FOXO4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.