ADO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-408985-ACT-2

A ADO humana (2-aminoetanotiol dioxigenase) é uma enzima de ferro não heme que catalisa a oxidação dependente de oxigênio da cisteamina em hipotaurina, sustentando a biossíntese celular de taurina e, de modo mais amplo, o metabolismo de aminoácidos sulfurados. Ao conectar o turnover de cisteamina à homeostase redox e ao metabolismo mitocondrial, a atividade da ADO se cruza com vias que regulam respostas ao estresse oxidativo e a adaptação bioenergética em tecidos metabolicamente ativos. A desregulação do equilíbrio taurina/hipotaurina e do metabolismo de tióis tem sido implicada em condições associadas à disfunção mitocondrial e ao manejo alterado de espécies reativas de oxigênio, tornando a ADO um alvo útil para estudos mecanísticos. A edição gênica ou a perturbação da ADO permite que pesquisadores investiguem o fluxo de metabólitos derivados da cisteamina, a biologia de dioxigenases dependentes de ferro e os impactos subsequentes em fenótipos celulares de estresse em sistemas modelo humanos relevantes.

ADO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADO sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ADO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADO em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADO, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ADO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADO nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ADO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ADO em células tumorais com expressão de ADO silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.