14-3-3 η Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402892-ACT

YWHAH codifica la proteina adattatrice umana 14-3-3 eta (η), un membro della famiglia 14-3-3 che si lega a motivi fosfoserina/fosfotreonina per modulare la localizzazione, la stabilità delle proteine e l’assemblaggio dei complessi di segnalazione. Attraverso interazioni con diverse chinasi, fosfatasi e regolatori trascrizionali, 14-3-3η partecipa al controllo dipendente dalla fosforilazione della progressione del ciclo cellulare, delle risposte allo stress e dell’apoptosi, intersecando vie come MAPK/ERK, PI3K–AKT e la segnalazione RAF. Alterazioni dell’attività di YWHAH sono state investigate in contesti di proliferazione e sopravvivenza deregolate, inclusi fenotipi legati alla neurobiologia e la riprogrammazione della segnalazione associata al cancro. In quanto scaffold che integra molteplici input di segnalazione, 14-3-3η è spesso studiata per il suo impatto su proteostasi, dinamica del citoscheletro e programmi trascrizionali dipendenti dal contesto.

14-3-3 η Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di YWHAH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

14-3-3 η Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus YWHAH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione YWHAH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 14-3-3 η. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus YWHAH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 14-3-3 η nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 14-3-3 η nelle cellule tumorali con espressione di YWHAH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.