γC-crystallin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402940-ACT

CRYGC codifica la γC-cristallina umana, una proteina strutturale altamente abbondante del cristallino che contribuisce all’indice di rifrazione e alla trasparenza a lungo termine attraverso complessi proteici stabili e densamente impacchettati. In quanto membro della superfamiglia delle β/γ-cristalline, la γC-cristallina sostiene l’architettura delle cellule delle fibre del cristallino e la proteostasi in condizioni di ricambio proteico minimo. L’alterazione dell’omeostasi delle cristalline può favorire il misfolding e l’aggregazione proteica, collegando la disregolazione di CRYGC a fenotipi di opacità del cristallino. CRYGC è quindi ampiamente utilizzato come marcatore e come punto di accesso meccanicistico per lo studio dello sviluppo del cristallino, delle risposte allo stress e dei processi di aggregazione proteica rilevanti per la biologia della cataratta.

γC-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRYGC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γC-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRYGC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRYGC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γC-crystallin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRYGC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γC-crystallin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γC-crystallin nelle cellule tumorali con espressione di CRYGC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.