α-tectorin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405876-ACT

TECTA codifica l’α-tectorina, una delle principali glicoproteine non collagene della membrana tettoria dell’orecchio interno, che contribuisce a organizzare l’architettura della matrice extracellulare necessaria per un’efficiente trasduzione meccanoelettrica da parte delle cellule ciliate cocleari. Attraverso il suo ruolo nell’assemblaggio della matrice e nell’accoppiamento strutturale tra la membrana tettoria e le stereociglia, l’α-tectorina sostiene le forze di taglio indotte dal suono e la selettività in frequenza. L’alterazione di TECTA può compromettere l’integrità della membrana tettoria e modificare la funzione uditiva, rendendolo un gene chiave per lo studio della biologia della matrice extracellulare sensoriale. Le varianti di TECTA sono associate a forme ereditarie di deficit uditivo, collegando la funzione dell’α-tectorina a fenotipi rilevanti per la malattia in modelli di ricerca sull’udito.

α-tectorin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TECTA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-tectorin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TECTA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TECTA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-tectorin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TECTA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-tectorin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-tectorin nelle cellule tumorali con espressione di TECTA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.