Plasmide CRISPR d'Activation (h) αA-crystallin: sc-402047-ACT

CRYAA code l’αA-cristalline humaine, une petite protéine de choc thermique qui agit comme chaperon moléculaire indépendant de l’ATP afin de maintenir la protéostasie en empêchant l’agrégation de protéines partiellement dépliées. Fortement exprimée dans le cristallin, l’αA-cristalline contribue également à l’organisation du cytosquelette, à la tolérance au stress et à la régulation de l’apoptose via ses interactions avec des protéines clientes et d’autres réseaux de chaperons. L’activité de CRYAA est liée aux réponses cellulaires au stress oxydant et aux voies de contrôle qualité des protéines, essentielles au maintien de la transparence du cristallin. La dérégulation ou les mutations de CRYAA sont associées à des phénotypes d’agrégation protéique et ont été impliquées dans la pathologie moléculaire liée à la cataracte ainsi que, plus largement, dans la biologie des réponses au stress.

αA-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRYAA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

αA-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRYAA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRYAA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de αA-crystallin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRYAA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de αA-crystallin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie αA-crystallin dans les cellules tumorales présentant une expression de CRYAA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.