Plásmido CRISPR de Activación (h) αA-crystallin: sc-402047-ACT

CRYAA codifica la αA-cristalina humana, una pequeña proteína de choque térmico que actúa como chaperona molecular independiente de ATP para mantener la proteostasis al evitar la agregación de proteínas parcialmente desplegadas. Altamente expresada en el cristalino del ojo, la αA-cristalina también contribuye a la organización del citoesqueleto, la tolerancia al estrés y la regulación de la apoptosis mediante interacciones con proteínas cliente y otras redes de chaperonas. La actividad de CRYAA se vincula a las respuestas celulares al estrés oxidativo y a las vías de control de calidad de proteínas, fundamentales para mantener la transparencia del cristalino. La desregulación o las mutaciones de CRYAA se asocian con fenotipos de agregación proteica y se han implicado en la patología molecular relacionada con las cataratas y, de forma más amplia, en la biología de la respuesta al estrés.

αA-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRYAA sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

αA-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRYAA en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRYAA, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de αA-crystallin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRYAA y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de αA-crystallin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía αA-crystallin en células tumorales con expresión de CRYAA silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.