WDHD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-408824-ACT

WDHD1 (proteína 1 de ligação ao DNA com repetições WD e HMG-box) é um fator conservado de replicação e manutenção do genoma que coordena o início da replicação do DNA, a progressão da forquilha de replicação e a resposta ao estresse replicativo. Em células humanas, WDHD1 sustenta a organização do replissomo e a progressão adequada da fase S, conectando a síntese de DNA a checkpoints e a processos de reparo que preservam a integridade do genoma. A expressão ou atividade desregulada de WDHD1 está associada a fenótipos proliferativos e já foi relatada em múltiplos contextos de câncer, de acordo com seu papel em sustentar uma transição rápida pelo ciclo celular. Como regulador associado à cromatina da dinâmica de replicação, WDHD1 é frequentemente estudada em vias que governam a sinalização de dano ao DNA, a estabilidade da forquilha de replicação e a segregação cromossômica.

WDHD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de WDHD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

WDHD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus WDHD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição WDHD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de WDHD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus WDHD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de WDHD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via WDHD1 em células tumorais com expressão de WDHD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.