VGAT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401850-ACT

SLC32A1 codifica o transportador vesicular de GABA (VGAT), uma proteína de membrana de vesículas sinápticas que carrega GABA e glicina para dentro de vesículas secretoras, permitindo a neurotransmissão inibitória. Ao controlar a captação vesicular e o tamanho quântico, o VGAT regula o equilíbrio entre excitação e inibição, a plasticidade sináptica e as oscilações de redes neuronais em todo o sistema nervoso central. A sinalização inibitória alterada, associada à desregulação da atividade de SLC32A1/VGAT, é relevante para estudos sobre epilepsia, fenótipos relacionados à ansiedade, transtornos do neurodesenvolvimento e distúrbios do movimento, nos quais a inibição em nível de circuitos está perturbada. Como transportador vesicular, a função do VGAT se relaciona com o ciclo das vesículas sinápticas, o metabolismo de neurotransmissores e processos de transporte dependentes de gradientes iônicos que moldam a eficácia das sinapses inibitórias.

VGAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC32A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VGAT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC32A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC32A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VGAT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC32A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VGAT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VGAT em células tumorais com expressão de SLC32A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.