VAMP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401607-ACT

VAMP1 codifica a proteína de membrana associada a vesículas 1 (VAMP-1), uma SNARE da família sinaptobrevina que medeia o acoplamento (docking) de vesículas sinápticas e a fusão de membranas necessária para a liberação de neurotransmissores desencadeada por Ca2+. A VAMP-1 participa de vias centrais de exocitose pré-sináptica por meio da formação de complexos SNARE com sintaxinas e SNAP-25, sustentando a ciclagem rápida de vesículas e a transmissão sináptica. A interrupção da fusão de vesículas dependente de VAMP1 perturba a comunicação neuronal e tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuromusculares, tornando-a relevante para o estudo de disfunção sináptica. Em modelos de células humanas, a regulação de VAMP1 também é útil para investigar a dinâmica do tráfego de membranas e a secreção dependente de atividade.

VAMP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VAMP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VAMP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VAMP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VAMP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VAMP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VAMP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VAMP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VAMP-1 em células tumorais com expressão de VAMP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.