V-ATPase D1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403669-ACT

ATP6V0D1 codifica a subunidade D1 da ATPase de protões do tipo V (V-ATPase) do setor membranar V0, um componente central da bomba rotativa de protões que acidifica endossomas, lisossomas e outros organelos intracelulares. Por meio da acidificação dos organelos, a atividade da V-ATPase sustenta a endocitose mediada por recetores, a proteólise lisossomal, a autofagia e o tráfego vesicular, e contribui para a homeostase do pH em vários tipos celulares. A montagem adequada da V-ATPase e a translocação de protões também são importantes para plataformas de sinalização endolisossomais, incluindo vias que dependem da função dos lisossomas, como a deteção de nutrientes pelo mTORC1. A desregulação da acidificação e do tráfego endolisossomais está associada à neurodegeneração, a respostas imunitárias alteradas e a fenótipos de invasão associados ao cancro, tornando o ATP6V0D1 um alvo relevante para estudos mecanísticos da função dos organelos.

V-ATPase D1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6V0D1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

V-ATPase D1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6V0D1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6V0D1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de V-ATPase D1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6V0D1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de V-ATPase D1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via V-ATPase D1 em células tumorais com expressão de ATP6V0D1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.