Unc18-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403691-ACT

STXBP2 codifica a proteína ligante de sintaxina 2 (Unc18-2), um regulador da família Sec1/Munc18 da montagem do complexo SNARE, essencial para o ancoramento de vesículas e a fusão de membranas. Em células imunes, a Unc18-2 sustenta a exocitose de grânulos citotóxicos e a secreção regulada, integrando-se a vias que controlam a desgranulação, o tráfego endolisossomal e a remodelação de membranas. Alterações na função de STXBP2 têm sido associadas a fenótipos de desregulação imunitária, tornando-o relevante para estudar defeitos de secreção mediada por vesículas e programas inflamatórios de sinalização a jusante. A sua atividade também é informativa em contextos mais amplos do controlo da via secretora, incluindo a reciclagem de recetores e a comunicação célula-célula.

Unc18-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STXBP2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Unc18-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STXBP2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STXBP2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Unc18-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STXBP2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Unc18-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Unc18-2 em células tumorais com expressão de STXBP2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.