UFD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403304-ACT

UFD1L codifica a UFD1, um componente central do complexo UFD1–NPL4–VCP/p97, que acopla o reconhecimento de ubiquitina à extração, dependente de ATP, de proteínas de membranas e de assemblies macromoleculares para degradação pelo proteassoma. Esse eixo sustenta a degradação associada ao retículo endoplasmático (ERAD), o controle de qualidade associado aos ribossomos e a resolução de complexos proteicos estagnados, mantendo assim a proteostase sob estresse. Por meio desses processos, a UFD1 influencia a progressão do ciclo celular, a estabilidade do genoma e as respostas ao estresse por proteínas mal dobradas. A desregulação das vias de controle de qualidade ligadas a UFD1L tem sido associada à tolerância ao estresse alterada e a fenótipos observados em distúrbios que envolvem desequilíbrio da proteostase e anomalias cromossômicas, o que sustenta sua utilidade na modelagem mecanística de doenças.

UFD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UFD1L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UFD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UFD1L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UFD1L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UFD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UFD1L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UFD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UFD1 em células tumorais com expressão de UFD1L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.