TSHR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400848-ACT

O recetor da hormona estimuladora da tiroide (TSHR) é um GPCR de classe A glicosilado, expresso principalmente nas células foliculares da tiroide, onde transduz os sinais de TSH provenientes da hipófise para regular a biossíntese das hormonas tiroideias e o crescimento da glândula. Após a ligação do ligando, o TSHR ativa a sinalização dependente de Gαs via cAMP/PKA e também pode acoplar-se às vias de Gαq/PLC e MAPK, coordenando programas transcricionais que controlam a captação de iodeto, o processamento da tiroglobulina e a diferenciação específica da tiroide. A desregulação da sinalização ou da expressão do TSHR está associada a doença tiroideia autoimune, incluindo a doença de Graves, e a alterações da homeostase tiroideia que podem contribuir para nódulos hiperfuncionantes e transformação neoplásica. Como recetor de superfície que integra sinais endócrinos e relacionados com o sistema imunitário, o TSHR é um modelo-chave para estudar o tráfego de GPCR, a dessensibilização do recetor e as redes regulatórias da linhagem tiroideia.

TSHR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TSHR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TSHR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TSHR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TSHR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TSHR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TSHR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TSHR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TSHR em células tumorais com expressão de TSHR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.