TRPV5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403668-ACT

O TRPV5 codifica um canal catiônico da família TRP altamente seletivo para cálcio e constitutivamente ativo, predominantemente localizado na membrana apical de células epiteliais, onde medeia a entrada transcelular de Ca2+. A atividade do canal é coordenada com vias de homeostase do cálcio, incluindo o tamponamento por calbindina e a extrusão basolateral por troca Na+/Ca2+ e por Ca2+-ATPases, e é modulada por fatores como Ca2+ intracelular, pH e sinalização calciotrópica. A função do TRPV5 está intimamente ligada a programas de transporte iônico epitelial e à fisiologia da reabsorção de cálcio, tornando-o um nó relevante para o estudo do metabolismo mineral e do transporte através de barreiras epiteliais. A expressão ou atividade desregulada de TRPV5 tem sido associada a fenótipos de manuseio alterado de cálcio e vem sendo investigada em contextos de distúrbios do equilíbrio renal e sistêmico do cálcio.

TRPV5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRPV5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRPV5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRPV5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRPV5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRPV5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRPV5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRPV5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRPV5 em células tumorais com expressão de TRPV5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.