TRPC6 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423517-ACT

Trpc6 codifica TRPC6, un canale cationico non selettivo permeabile al calcio che agisce a valle della segnalazione della fosfolipasi C, accoppiando la stimolazione recettoriale all’ingresso intracellulare di Ca²⁺. Nelle cellule murine, TRPC6 partecipa alla regolazione dell’eccitabilità di membrana, del rimodellamento del citoscheletro e delle risposte meccanosensibili, integrando segnali provenienti da recettori accoppiati a proteine G e da recettori tirosin-chinasici. L’attività del canale influenza vie dipendenti dal Ca²⁺, incluse la segnalazione calcineurina/NFAT e MAPK, modellando programmi trascrizionali e la contrattilità cellulare. Una segnalazione TRPC6 deregolata è stata associata alla biologia glomerulare renale e alla funzione dei podociti, nonché a processi di rimodellamento vascolare e cardiaco, rendendola rilevante per lo studio della fisiopatologia guidata dal calcio.

TRPC6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Trpc6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPC6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Trpc6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Trpc6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPC6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Trpc6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPC6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPC6 nelle cellule tumorali con espressione di Trpc6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.