Plásmido CRISPR de Activación (h) Trichohyalin: sc-401940-ACT

TCHH codifica la tricohialina, una proteína estructural altamente reticulada, enriquecida en la vaina radicular interna de los folículos pilosos y en queratinocitos en proceso de diferenciación. La tricohialina es un sustrato principal de las peptidilarginina deiminasas y de las transglutaminasas, favoreciendo la citrulinación y el entrecruzamiento por enlaces isopéptidos que estabilizan la envoltura cornificada y refuerzan la mecánica de la barrera epitelial. A través de su integración con los filamentos intermedios de queratina y el programa de queratinización, TCHH contribuye a la morfogénesis folicular, la arquitectura del tallo piloso y la diferenciación epidérmica. La expresión o el procesamiento desregulados de la tricohialina se han asociado con fenotipos en pelo y piel, lo que la hace relevante para estudios de biología del folículo, trastornos de la barrera y respuestas al estrés epitelial.

Trichohyalin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TCHH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Trichohyalin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TCHH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TCHH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Trichohyalin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TCHH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Trichohyalin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Trichohyalin en células tumorales con expresión de TCHH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.