Plasmide CRISPR d'Activation (h) TPPII: sc-403717-ACT

Le gène humain **TPP2** code la tripeptidyl peptidase II (TPPII), une grande exopeptidase à sérine cytosolique qui raccourcit les oligopeptides générés par le système ubiquitine–protéasome et contribue au contrôle qualité des protéines ainsi qu’au renouvellement des peptides intracellulaires. En régulant le traitement des peptides, TPPII influence la protéostasie, la disponibilité des peptides antigéniques pour la présentation par le CMH de classe I, et des voies d’adaptation au stress liées à la survie cellulaire et à l’apoptose. Des altérations de l’activité TPP2/TPPII ont été associées à une protéolyse dérégulée et à des phénotypes liés au système immunitaire, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques sur la compensation du protéasome, la signalisation inflammatoire et les transitions d’état cellulaire en situation de stress protéotoxique. TPP2 constitue donc un nœud utile pour analyser comment les peptidases cytosoliques façonnent les voies de dégradation des protéines et les réponses cellulaires en aval dans des systèmes modèles humains.

TPPII Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TPP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TPPII Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TPP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TPP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TPPII. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TPP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TPPII au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TPPII dans les cellules tumorales présentant une expression de TPP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.