TBCK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409581-ACT

TBCK (TBC1 domain containing kinase) codifica un regolatore citosolico multidominio implicato nel traffico di membrana e nel controllo della crescita, con ruoli riportati in processi associati alle GTPasi Rab e in reti di segnalazione che influenzano l’omeostasi cellulare. Nell’uomo, TBCK è stato collegato alla modulazione delle vie associate a mTOR e alla funzione del sistema autofagia-lisosoma, mettendolo in relazione con i meccanismi che regolano dimensioni cellulari, metabolismo e risposte allo stress. Un’alterata attività di TBCK è stata associata a fenotipi di neurosviluppo e a patologie sindromiche, a supporto della sua rilevanza nello studio del mantenimento neuronale, della proteostasi e della disregolazione della segnalazione. Queste caratteristiche rendono TBCK un bersaglio utile per studi meccanicistici sul trasporto intracellulare e sul crosstalk tra vie di segnalazione.

TBCK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TBCK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TBCK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TBCK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TBCK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TBCK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TBCK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TBCK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TBCK nelle cellule tumorali con espressione di TBCK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.