T1R2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402555-ACT

O TAS1R2 humano codifica a subunidade do receptor de sabor doce T1R2, um GPCR de classe C que forma um heterodímero com o TAS1R3 para detectar açúcares e adoçantes. Para além da perceção do paladar na cavidade oral, o T1R2 contribui para a deteção de nutrientes em tecidos extraorais como o intestino e o pâncreas, influenciando a sinalização dependente de glucose, a secreção hormonal e a homeostase metabólica através de vias de segundos mensageiros mediadas por GPCR. Alterações na expressão ou na sinalização do TAS1R2 têm sido investigadas no contexto de desregulação do equilíbrio energético e do metabolismo da glucose, incluindo associações descritas na investigação sobre doenças metabólicas. Como recetor sensor de nutrientes, o T1R2 constitui um modelo acessível para estudar o tráfego do recetor, a heterodimerização e as respostas transcricionais a estímulos de hidratos de carbono.

T1R2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TAS1R2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

T1R2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TAS1R2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TAS1R2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de T1R2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TAS1R2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de T1R2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via T1R2 em células tumorais com expressão de TAS1R2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.