STRAD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402311-ACT

STRADA codifica a STRAD, uma pseudocinase cataliticamente inativa que forma um complexo com LKB1 (STK11) e com a proteína de andaime MO25 para promover a localização citoplasmática e a ativação de LKB1. Por meio desse complexo, STRAD sustenta cascatas de fosforilação que influenciam a sinalização de quinases relacionadas à AMPK, o sensoriamento energético celular, a polaridade e o controle do crescimento, com impactos a jusante em processos como a organização do citoesqueleto e respostas ao estresse. A disrupção ou a regulação alterada de STRADA tem sido associada a fenótipos de neurodesenvolvimento e a redes de sinalização desreguladas que se cruzam com vias frequentemente estudadas na biologia da proliferação e da migração. Como resultado, STRAD é comumente investigada como um nó regulatório que conecta o scaffolding de quinases, a localização subcelular e programas transcricionais dependentes do contexto.

STRAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STRADA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

STRAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STRADA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STRADA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de STRAD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STRADA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de STRAD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via STRAD em células tumorais com expressão de STRADA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.